漫漫长路需求索 步步阶梯到《科学》

——记在《科学》发表高水平论文的威尼斯9499登录入口生命科学院2010级博士生邓东

研通社记者  徐玲 时雪

图为邓东在做实验。

　　医学科学楼三层的墙壁上，粘贴着一篇篇威尼斯9499登录入口结构生物学中心发表的高水平学术论文，其中有一篇是最近发表于国际顶级学术期刊《科学》的文章，它的第一作者就是来自威尼斯9499登录入口生命科学学院、PTN博士生项目的2010级博士生邓东。师从威尼斯9499登录入口医学院颜宁教授，邓东与闫创业、潘孝敬两位同学用了不过半年的时间，在世界上首先解析出了TALE（Transcription Activator Like Effectors）蛋白——转录激活因子样效应蛋白在有无DNA结合两种状态下的高分辨率晶体结构，揭示了其特异识别DNA的分子机理。《科学》于2012年1月5日发表了他们的论文《Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors》（TALE蛋白特异性识别DNA的分子机制）。

　　之后几个月，邓东又以第一作者或者共同第一作者身份在Cell Research（细胞研究）和Cell Reports（细胞报告）期刊上分别发表了《Recognition of methylated DNA by TAL effectors》和《Specific DNA-RNA Hybrid Recognition by TAL Effectors》两篇文章。

　　作为一名博士研究生，邓东用自己出色的成绩书写着自己对于科研的热爱。邓东一直对生物抱有浓厚的兴趣，在接受这个课题之前，他已在颜宁教授的实验室工作了2年。当面对是去一家外国公司工作，还是在威尼斯9499登录入口读博时，他毅然决然地选择了后者，因为他享受科研生活给自己带来的乐趣。

　　TALE蛋白是生物技术领域里很重要的一类蛋白，早已得到广泛地应用。但是人们对它的工作机制即如何特异性识别DNA却一无所知，这也限制了它扩大应用范围。邓东之前一直从事的是对于膜蛋白的结构生物学研究，但是在平时的论文阅读中早就关注到了这一类神奇的DNA识别蛋白。所以当朱健康教授向颜宁教授提出合作研究dHax3这种TALE蛋白结构的意向时，正中邓东下怀。他正是想突破TALE结构未知这一障碍，扛下了这个课题，他希望从结构生物学的角度去研究它的工作机理。正如他所说：“这个问题就像病人吃药一样，如果不知道它如何发挥功效，势必会出现问题。”

图为邓东在做实验。

　　自此，邓东和他的两个同伴便在“研究TALE蛋白如何特异性识别DNA”这条道路上苦苦摸索，尽管从课题开始到取得成果只有短短的半年，但这其中的辛苦只有他们自己知道。从2011年3月他们接受课题，到10月15日成功解析出蛋白结构，再到一鼓作气地撰写文章并于10月21日将文章投出，这背后的汗水、沮丧、欣喜、坦然，也只有他们自己才能深刻体会。

　　结构生物学的研究主要分为几大步骤，每一步都有各自的困难和失败的可能。选择了dHax3这个TALE蛋白，邓东要面对的第一个难题就是得到大量的蛋白样品。虽然在基因序列克隆上没有遇到什么困难，但接下来的蛋白表达就碰上了大麻烦。他们经过了大量的尝试始终拿不到理想的蛋白，这意味着不能将实验继续进行下去。邓东和同伴们也尝试了其它几种常规菌种，依旧没有什么收获。

　　就在这焦头烂额之际，邓东在翻阅文献时偶然发现了一种菌种（Rosetta（DE3）），而实验室恰巧有同学使用过。经过新的试验之后，效果出其意料的好，蛋白表达量特别高。“struggle（挣扎）了一个月一无所获，而有一天你突然在网上或文献里发现某种方法能使蛋白表达，那种感觉太棒了”，邓东兴奋之情溢于言表。

　　接下来面对的更大挑战就是蛋白提纯，蛋白虽然表达量很大，但是并不好纯化。刚开始摸索的蛋白纯化过程不但花费时间较长，而且蛋白的产率及纯度都达不到实验要求。为了得到高蛋白产率和纯度，他们又进行了长时间的蛋白纯化实验的优化。为了尝试更多的条件和方法，他们经常通宵达旦地在实验室奋战。功夫不负有心人，两个多月过去了，他们不但能稳定地拿到性质很好的蛋白样品，同时也拿到了TALE的第一颗蛋白晶体。“其实这个过程是存在风险的，一旦不成功，就意味着之前的工作功亏一篑，一切从头开始。但这就是个实验科学，你需要去做更多的尝试才能得到自己所满意的结果。我始终记得颜宁老师跟我说的‘you never know before you try it’（你在尝试之前永远不知道会是什么样子）”，说到这儿，邓东语重心长。

　　通过X射线对晶体进行衍射分析，经过电脑对数据的处理，他们离得到TALE蛋白的结构便只有咫尺之遥。然而，天将降大任于是人也，必先苦其心志，劳其筋骨。通向光明之路总是充满荆棘，晶体的衍射分析数据并不理想。“很沮丧，我们废了半天的劲还是得不到好的数据，又不知道其原因。衍射数据不好的话，我们就解不出其结构”，邓东焦虑地说。近一个月的纠结终结于邓东和颜宁老师一次随意的谈话和他自己的勇敢尝试，颜宁老师跟邓东说，要么你试试脱水（一种优化晶体的方法）, 邓东迅速进行了实验，所幸马上就有了突破性的结果。尝试之下发现，分辨率一下子提高了很多，从3埃提高到2埃（就像近视的人裸眼看东西和带着眼镜看东西的差别），TALE蛋白的结构解析迎刃而解。说到这，邓东补充道：“颜老师丰富的科研经验，对我的帮助相当大。她自己可能都没有意识到的随口而出的建议，给我们的实验带来了突破性的进展。”

　　然而，让邓东他们没有想到的是实验最艰辛的部分才刚刚开始。因为在对晶体进行衍射数据收集时，它的相位信息会发生丢失。他们必须解决相位问题，才能解析晶体结构。在接下来两个月的时间里，他们几乎把所有能解决相位问题的方法都尝试了一遍，收集了上百套的衍射数据进行分析，最终克服了这个困难。而在这期间，邓东他们都要拎着沉淀淀的低温保存罐把晶体带到上海或者日本的同步辐射中心进行衍射数据的收集。他们去那里经常得连续工作，比如今天早上8点开始工作，直到第二天早上8点才结束。拿到数据后回学校分析，数据不好则继续准备晶体，下周继而出远门。那段艰辛又奔波的岁月，他至今记忆犹新。

　　TALE蛋白的结构已经拿到，剩下的就是分析它是如何特异性识别DNA的，这也是解密其生化功能的关键所在。经过一番认真琢磨和分析，特别是在对蛋白质和DNA研究方面具有二十年丰富研究经验的施一公教授的点拨下，邓东和他的同伴终于突破重重阻碍揭开了TALE蛋白工作机制的神秘面纱。

　　“《科学》是在12月21日接收这篇文章的，过两天刚好是我的生日，”邓东说，这无疑是给他最好的生日礼物。

　　TALE蛋白特异性识别DNA的工作机制研究出来后，他们就把这个课题搁置不理了吗？  

　　NO！

　　接下来，他们反而更加细微地观察TALE蛋白结构，发现TALE上有能特异性识别含有5-甲基胞嘧啶修饰的基因。而5-甲基胞嘧啶是一种重要的DNA甲基化修饰，是表观遗传学研究的重点，他们首次将TALE和表观遗传学研究联系起来。

　　此外，通过与博士后殷平合作，他们还发现TALE只与DNA双螺旋的一条链结合。如果把另外一条不结合的链换成RNA或者其他杂链，是否会有同样的结果。带着这个疑问，他们又开始进行繁复的试验。结果表明，TALE蛋白不但能识别双链DNA，还能识别DNA-RNA杂合双链。

　　这两点发现也分别发表于Cell Research 和 Cell Reports 期刊上。

　　科研生活并非一帆风顺，往往夹杂着很多的挫败和曲折。这种时候邓东会叫上实验室的兄弟姐妹们去K歌或者打打羽毛球来缓解压力。“我的羽毛球打得不如林丹好，但是林丹提蛋白、长蛋白晶体肯定比不过我”，邓东对于科研的热爱和自信溢于言表，“我觉得科研能实现我的人生价值，我也想继续做下去”。

　  科研之路漫漫，《科学》是成就也是新起点，邓东的步步踏实将为他的未来带来新的无限可能！

　　导师颜宁评语：宝剑锋从磨砺出

　　我从事结构生物学研究已经有十多年，但是如此重要的一个课题由如此“年轻”的学生在如此短的时间内完成，在我看来都算是一个奇迹，邓东正是这个奇迹的创造者，而奇迹的背后是在之前几年扎扎实实的积淀。与我诸多来自名校的直博生不同，邓东在读博之前先是在公司工作，然后在实验室里做技术员。也许正是这些经历，使他与同年级的同学相比多了一份成熟与从容，更有一份经过思考之后的坚定。作为一个导师，还有什么比看着学生创造奇迹更令人欣慰的呢？